Законодательство СССР




Поиск документов на сайте

Утверждены 

Министерством здравоохранения СССР 

29 июля 1991 г. N 6133-91 

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ 

СРЕДАХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 

 

(Дополнение к Методическим указаниям N 4323-87 от 08.06.87) 

 

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде. 

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками. 

 

1. Краткая характеристика 

 

Фосфамид (рогор, БИ-58) в организме теплокровных животных и человека образует продукты превращения: 

0,0-диметил-S-карбонилметилдитиофосфат (диметоат-карбоновая кислота, температура плавления 42 °C); 

0,0-диметил-S-карбметоксиметилдитиофосфат, температура кипения 

20 

98 - 99 °C при 6,7 Па, n = 1,5200; 

альфа 

0,0-диметилдитиофосфорная кислота, температура кипения 52 - 55 

20 

°C при 10,66 Па, n = 1,5340; 

альфа 

20 

0,0-диметилтиофосфорная кислота, n = 1,4800; 

альфа 

0,0-диметилфосфорная кислота, температура кипения 79 - 80 °C 

20 

при 0,13 Па, n = 1,4082. 

альфа 

Указанные метаболиты могут образовываться при метаболизме других пестицидов, сходных по химическому строению с фосфамидом. 

Метаболиты хорошо растворимы в органических растворителях, в том числе в ацетоне, этаноле, хлороформе, этилацетате и др. 

 

2. Методика определения метаболитов фосфамида 

в биологических средах (ткани внутренних органов, 

кровь, моча) 

 

2.1. Основные положения 

 

2.1.1. Принцип метода 

Метод основан на экстракции метаболитов фосфамида из биологических сред органическим растворителем (хлороформ или этилацетат), очистке полученных экстрактов и последующем определении методом тонкослойной хроматографии. Хроматографирование исследуемых соединений проводят в подвижных фазах на основе ацетона, включающих малополярные и полярные растворители. Проявление на хроматограммах с помощью проявляющих реагентов: 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, а также 4-(п-нитробензил)пиридина с последующей обработкой тетраэтиленпентамином. 

2.1.2. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1. 

 

Таблица 1 

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ 

МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ 

 

TTTT 

¦ Метаболиты фосфамида ¦ Минимально ¦Нижний ¦Аналитическая ¦Примечание¦ 

¦ ¦детектируемое¦предел ¦открываемость ¦ ¦ 

¦ ¦ количество ¦обнару-¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ ¦жения, ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ ¦мкг/мл ¦ ¦ ¦ 

++++++ 

¦Метаболит N 1 ¦1 мкг ¦0,5 ¦80,5 +/- 8,5% ¦ткани ¦ 

¦(0,0-диметил-S- ¦ ¦ ¦ ¦внутренних¦ 

¦карбонилметилдитиофосфат) ¦ ¦ ¦ ¦органов ¦ 

¦ ¦ ¦0,04 ¦82,0 +/- 10,8%¦моча ¦ 

¦ ¦ ¦1,0 ¦80,5 +/- 10,0%¦кровь ¦ 

++++++ 

¦Метаболит N 2 ¦5 мкг ¦5,0 ¦78,5 +/- 12,5%¦кровь ¦ 

¦(0,0-диметилфосфорная кислота)¦ ¦0,2 ¦80,5 +/- 11,8%¦моча ¦ 

¦ ¦ ¦2,5 ¦78,9 +/- 10,3%¦ткани ¦ 

++++++ 

¦Метаболит N 3 ¦2 мкг ¦1,0 ¦81,5 +/- 12,5%¦ткани ¦ 

¦(0,0-диметилтиофосфорная ¦ ¦2,0 ¦79,5 +/- 10,5%¦кровь ¦ 

¦кислота) ¦ ¦0,08 ¦82,8 +/- 8,5% ¦моча ¦ 

++++++ 

¦Метаболит N 4 ¦1 мкг ¦0,5 ¦82,4 +/- 12,5%¦ткани ¦ 

¦(0,0-диметилдитиофосфорная ¦ ¦1,0 ¦80,5 +/- 10,5%¦кровь ¦ 

¦кислота) ¦ ¦0,04 ¦85,5 +/- 10,0%¦моча ¦ 

++++++ 

¦Метаболит N 5 ¦1 мкг ¦0,5 ¦82,9 +/- 8,5% ¦ткани ¦ 

¦(0,0-диметил- ¦ ¦1,0 ¦79,6 +/- 9,5% ¦кровь ¦ 

¦карбметоксиметилдитиофосфат) ¦ ¦0,04 ¦85,4 +/- 10,6%¦моча ¦ 

L++++ 

 

Примечание: в модельные опыты вносили по 10, 20, 50, 100 мкг исследуемых веществ. Количество опытов 60 (P = 0,05). 

 

2.1.3. Избирательность метода 

В условиях двумерной хроматографии после I хроматографирования из указанной выше смеси метаболитов + фосфамид раздельно определяются фосфамид, "диметоат-карбоновая кислота" и 0,0-диметилкарбметилдитиофосфат, а после II хроматографирования раздельно определяются 0,0-диметилфосфорная кислота и (или) 0,0-диметилтиофосфорная кислота (или 0,0-диметилдитиофосфорная кислота). 

Последние две кислоты, если не присутствуют одновременно в пробе, отличаются окраской зоны локализации при взаимодействии с 2,6-дибром-N-хлорхинонимином. 

Определению не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе (с учетом технологии возделывания с/х культур), - диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан. 

 

2.2. Реактивы и растворы 

 

0,0-Диметил-S-карбонилметилдитиофосфат ("диметоат-карбоновая кислота", метаболит N 1). 

0,0-Фосфорная кислота хч (метаболит N 2). 

0,0-Диметилтиофосфорная кислота хч (метаболит N 3). 

0,0-Диметилдитиофосфорная кислота хч (метаболит N 4). 

0,0-Диметилкарбометоксиметилдитиофосфат (метаболит N 5). 

Фосфамид хч или товарная форма пестицида (40-процентный или 38-процентный концентрат эмульсии). 

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79. 

Бензол хч, ГОСТ 5955-75. 

н-Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78. 

Хлороформ хч, ТУ 6-09-4263-76. 

Уксусная кислота хч, ГОСТ 61-75. 

Дистиллированная вода. 

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76. 

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-05-63-73, хч, 0,5-процентный раствор в гексане. 

4-(п-Нитробензил)пиридин, ТУ 6-09-15-93-74. 

Тетраэтиленпентамин, ТУ 6-09-05-804-78. 

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76. 

Натрий лимоннокислый чда, ГОСТ 22280-78, 5% раствор. 

Подвижные фазы: 

I хроматографирование: N 1 - бензол - этилацетат - ацетон (60:15:25), N 2 - гексан - ацетон - хлороформ (1:1:3) и N 3 - бензол - этилацетат - уксусная кислота (50:25:25:2). 

II подвижная фаза: ацетон - вода - этилацетат (4:6:2). 

Проявляющие реагенты: 

N 1 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, 0,5-процентный раствор в н-гексане; 

N 2 - а) 4-(п-нитробензил)пиридин, 2-процентный раствор в ацетоне, б) тетраэтиленпентамин, 10-процентный раствор в ацетона. 

Стандартные растворы исследуемых метаболитов и фосфамида в хлороформе или этилацетате с содержанием вещества 100 мкг/мл. Если стандартный раствор фосфамида готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают его процентное содержание в препарате. Срок хранения стандартных растворов до 1 месяца в холодильнике. 

 

2.3. Приборы, аппаратура, посуда 

 

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-76, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей. 

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный. 

Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74. 

Термостат. 

Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74. 

Стаканы, склянки химические емкостью 50 - 100 мл, ГОСТ 25336-82. 

Воронки химические, ГОСТ 25336-82. 

Воронки делительные, ГОСТ 25336-82. 

Колбы грушевидные, ГОСТ 25336-82 (для отгонки растворителей). 

Камера для хроматографирования, ГОСТ 25336-82. 

Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 25336-82. 

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82. 

Баня водяная, ТУ 64-12350-76. 

Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки. 

Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см. 

Линейка, планиметр, миллиметровая бумага. 

Измельчитель тканей, МРТУ 42-1505-63 или аналогичный. 

 

2.4. Проведение определения 

 

2.4.1. Экстракция и очистка экстрактов 

Ткани внутренних органов (печень, почки, легкие, селезенка, сердце) 

Измельченную пробу тканей внутренних органов массой 2 г помещают в склянку с притертой пробкой и приливают 10 мл охлажденного ацетона или этилацетата и встряхивают на холоде в течение 30 - 40 минут. Затем растворитель отделяют от пробы, фильтруя его через безводный сернокислый натрий (2 - 3 г) в колбу для отгонки растворителей. 

Экстракцию повторяют еще дважды, используя свежие порции растворителя. Объединенный экстракт отгоняют при температуре 40 - 50 °C до объема раствора примерно 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сернокислым натрием. 

Кровь. Пробу крови 0,5 - 1 мл вносили в пробирку, смоченную раствором лимоннокислого натрия, и приливали 10 мл хлороформа. Экстрагировали на холоде в течение 30 мин. Хлороформ отделяли от пробы, фильтровали через безводный сернокислый натрий (1 - 2). Экстракцию повторяли еще дважды, используя по 5 мл хлороформа, в течение 10 и 5 минут. Объединенные экстракты вносили в колбу для отгонки растворителей. 

Пробу крови можно поместить в ступку, куда насыпается 10 г безводного сернокислого натрия и растирается в течение 5 минут. Приливается 15 мл этилацетата и перемешивается содержимое ступки 20 минут. Этилацетат отделяется от массы и фильтруется через фильтр в колбу для отгонки растворителей. Сюда же фильтруются вторая и третья порции экстрагента (по 10 мл, экстракция по 5 минут). Растворитель отгоняется на ротационном испарителе при температуре 45 - 50 °C до остатка примерно 0,5 мл. Если остаток получился мутным, то его подсушивают безводным сернокислым натрием. Затем количественно переносят на хроматографическую пластинку. 

Моча. 25 мл исследуемой мочи помещают в колбу с притертой пробкой, приливают 2 - 5 мл хлористого натрия и 10 мл хлороформа или этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 30 минут (1 экстракция), 10 минут (2 и 3 экстракции). Органический растворитель отделяют от пробы, объединяют и пропускают через слой безводного сернокислого натрия (до 10 г). Переносят растворитель в колбу для отгона растворителей и отгоняют его до объема 0,5 мл при температуре 70 °C (50 °C). Если необходимо, остаток подсушивают безводным сернокислым натрием. Количественно переносят на хроматографическую пластинку. 

2.4.2. Хроматографирование 

Пробу 0,5 мл количественно переносят на хроматографическую 

пластинку, нанося ее на высоте 5 см от нижнего края пластинки. 

Слева и справа от пробы наносят смеси стандартных растворов 

фосфамида и его метаболитов N 1 - 5, содержащие по 1, 2, 5 и 10 

мкг каждого вещества. Помещают пластинку в камеру для 

хроматографирования, куда за 30 - 50 минут наливают одну из трех 

подвижных фаз для I хроматографирования. После окончания 

хроматографирования (высота подъема растворителей подвижной фазы 9 

- 10 см) и после улетучивания следов растворителей на расстоянии 

1,5 см от линии старта (по высоте) проводят горизонтальную линию, 

параллельную линии старта, и отрезают верхнюю часть пластинки. 

Обрабатывают ее одним из проявляющих реагентов, N 1 или 2. Если 

применяют ПР N 1, то после опрыскивания пластинку помещают в 

термостат при температуре 110 - 120 °C на 2 - 3 минуты. Фосфамид и 

метаболиты N 1 и N 5 проявляются в виде красно-кирпичного цвета 

пятен, метаболиты N 2, 3, 4 остались на нижней части пластинки. 

Если используют ПР N 2, то сначала обрабатывают пластинку 

раствором 4-(п-нитробензил)пиридина, помещают на 10 минут в 

термостат при 110 °C, а затем опрыскивают раствором 

тетраэтиленпентамина. Исследуемые вещества проявляются в виде 

синих пятен. Фосфамид и метаболиты N 1 и N 5 в подвижной фазе N 1 

имеют R , равное 0,44, 0,51, 0,96 соответственно, в подвижной фазе 

N 2 - 0,39, 0,28, 0,92, в подвижной фазе N 3 - 0,54, 0,66, и 0,92 

соответственно. 

Нижнюю часть пластинки поворачивают на 90 °C и наносят справа 

от пробы 2 или три стандартных раствора метаболитов N 2, N 3, N 4. 

Проводят II хроматографирование в подвижной фазе ацетон - вода - 

этилацетат (4:6:2). После поднятия фронта растворителя на 10 см и 

улетучивания следов подвижной фазы обрабатывают одним из двух 

проявляющих реагентов, как описано выше. Величина R метаболитов 

N 2, N 3, N 4 равна 0:0,50 и 0,50. Если метаболиты N 3 и N 4 

находятся одновременно в пробе, то они будут определяться 

суммарно, если же они не присутствуют одновременно, то их можно 

идентифицировать по окраске пятна: метаболит N 3 имеет желтого 

цвета пятна, а N 4 - кирпично-коричневого. 

 

2.5. Обработка результатов анализа 

 

Содержание метаболитов и фосфамида на хроматограммах проб определяют путем сравнения интенсивности окрашивания пятен и их площади на хроматограммах проб и стандартных растворов. Площадь пятен измеряют с помощью планиметра или промасленной миллиметровой бумаги. Содержание вещества на хроматограмме может быть определено с помощью денситометра. 

Для расчета содержания исследуемых веществ в биопробе используют формулу, в которую вносят площадь пятна на хроматограмме стандарта, наиболее близкую по размерам к площади пятна на хроматограмме пробы. 

Расчет концентрации исследуемого вещества в биопробе проводят по формуле: 

 

C x S x V 

ст пр 2 

X = --------------, 

S x V x P 

ст 1 

 

где: 

X - концентрация исследуемого вещества в пробе, мкг/мл, мкг/г; 

C - концентрация вещества на хроматограмме стандарта, мкг; 

ст 

S - площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм; 

ст 

S - площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм; 

пр 

V - хроматографический объем пробы, мл; 

V - общий объем пробы, мл; 

P - навеска пробы, г (или объем, мл). 

 

3. Требования безопасности 

 

Необходимо соблюдать все требования безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами и электронагревательными приборами. 

 

 

 

Форум
Открылся форум WorkLib.ru