Законодательство СССР




Поиск документов на сайте

Утверждены 

Министерством здравоохранения СССР 

29 июля 1991 г. N 6072-91 

 

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОП, ПРОИЗВОДНЫХ 

ТИО- И ДИТИОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ В БИОМАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ 

ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 

 

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде. 

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками. 

 

1. Краткая характеристика препарата 

 

Производные тио- и дитиофосфорных кислот являются основными метаболитами фосфорорганических пестицидов. Характеристика метаболитов ФОП представлена в таблице 1. 

 

Таблица 1 

 

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ 

 

TTTT 

¦ Химическое название ¦Структурная¦Мол.¦ T. кип., °C ¦Показатель ¦ 

¦ ¦ формула ¦вес ¦ ¦преломления¦ 

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ при 20 °C ¦ 

++++++ 

¦0,0-Диметилтиофосфорная кислота ¦CH O ¦142 ¦62 - 63 °C ¦1,5343 ¦ 

¦ ¦ 3 \ /S ¦ ¦4,5 мм рт. ст.¦ ¦ 

¦ ¦ P/ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ / \ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦CH O OH ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ 3 ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-Диэтилтиофосфорная кислота ¦C H O ¦170 ¦81 - 82 °C ¦1,5076 ¦ 

¦ ¦ 2 5 \ /S ¦ ¦5 мм рт. ст. ¦ ¦ 

¦ ¦ P/ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ / \ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦C H O OH¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ 2 5 ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-Диметилдитиофосфорная кислота¦CH O ¦158 ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ 3 \ /S ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ P/ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ / \ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦CH O SH ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ 3 ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-Диэтилдитиофосфорная кислота ¦C H O ¦186 ¦97 - 98 °C ¦1,5105 ¦ 

¦ ¦ 2 5 \ /S ¦ ¦2 мм рт. ст. ¦ ¦ 

¦ ¦ P/ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ / \ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦C H O SH¦ ¦ ¦ ¦ 

¦ ¦ 2 5 ¦ ¦ ¦ ¦ 

L++++ 

 

Метаболиты ФОП практически нерастворимы в воде, растворимы в 

ацетоне, диэтиловом эфире, этилацетате, спиртах. ЛД для белых 

50 

крыс диметилдитиофосфорной кислоты - 1460 мг/кг, карбофоса - 2000 

мг/кг (перорально). 

 

2. Методика определения метаболитов ФОП, производных тио 

и дитиофосфорных кислот в биологическом материале 

 

2.1. Основные положения 

 

2.1.1. Принцип метода 

Методика основана на определении алкилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот методом тонкослойной и газожидкостной хроматографии после экстракции всех анализируемых соединений из биосубстратов этилацетатом (10 мл x 3). 

ТСХ-определение проводят на пластинках "Силуфол" в подвижной фазе (ПФ) гексан:ацетон (3:1). В качестве проявляющих реагентов использовали: 

1) 4-(п-нитробензил)пиридин + тетраэтиленпентамин (синие пятна на белом фоне); 

2) тиокетон Михлера + хлорамин (салатовые пятна на желтом фоне); 

3) 2,6-дибром-N-хлорхинонимин (красно-кирпичные пятна на белом фоне); 

4) бромкрезоловый зеленый (желтые пятна на зеленом фоне); 

5) нингидрин (красные пятна на белом фоне); 

6) диметиламинобензальдегид (белые пятна на желтом фоне). 

ГЖХ-определение проводят на газовом хроматографе "Цвет-100", снабженном термоионным детектором. В качестве неподвижной фазы используют 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS. Разделение данных метаболитов проводят в изотермическом режиме при T к. = 120 °C, T исп. = 160 °C. 

2.1.2. Метрологическая характеристика метода 

Метрологическая характеристика метода определения метаболитов ФОП при внесении веществ In vitro в организм и ткани животных, мочу, кровь приведена в таблице 2. 

 

Таблица 2 

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ТСХ И ГЖХ 

АЛКИЛПРОИЗВОДНЫХ ТИО- И ДИТИОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ 

В БИОСУБСТРАТАХ <*> ПРИ ВНЕСЕНИИ ВЕЩЕСТВ (P = 0,95, N = 3) 

 

TTT 

¦ N ¦ Определяемое ¦ ТСХ ¦ ГЖХ ¦ 

¦п/п¦ вещество +TTT+TTT+ 

¦ ¦ ¦нижний¦среднее¦относ.¦довер.¦нижний¦среднее¦относ.¦довер.¦ 

¦ ¦ ¦предел¦значен.¦станд.¦интер-¦предел¦значе- ¦станд.¦интер-¦ 

¦ ¦ ¦обна- ¦опреде-¦откло-¦вал ¦обна- ¦ние ¦откло-¦вал ¦ 

¦ ¦ ¦руже- ¦ления, ¦нение ¦сред- ¦руже- ¦опреде-¦нение ¦сред- ¦ 

¦ ¦ ¦ния, ¦% ¦ ¦него, ¦ния, ¦ления, ¦ ¦него, ¦ 

¦ ¦ ¦мг/л ¦ ¦ ¦% ¦мг/л ¦% ¦ ¦% ¦ 

+++++++++++ 

¦1. ¦Диметилтиофос- ¦0,01 ¦68 ¦5,1 ¦2,3 ¦0,001 ¦69 ¦5,3 ¦2,4 ¦ 

¦ ¦форная кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦2. ¦Диэтилтиофосфор-¦0,01 ¦69 ¦4,7 ¦2,5 ¦0,001 ¦70 ¦4,6 ¦2,5 ¦ 

¦ ¦ная кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦3. ¦Диметилдитиофос-¦0,02 ¦71 ¦3,8 ¦1,7 ¦0,001 ¦72 ¦5,0 ¦2,5 ¦ 

¦ ¦форная кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦4. ¦Диэтилдитиофос- ¦0,02 ¦70 ¦4,6 ¦2,0 ¦0,001 ¦71 ¦5,1 ¦2,4 ¦ 

¦ ¦форная кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

L+++++++++ 

 

2.1.3. Избирательность метода 

Фосфорорганические пестициды не мешают определению амилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот. 

 

2.2. Реактивы и растворы 

 

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76. 

Этиловый спирт - ректификат 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77. 

Сульфат натрия хч, ГОСТ 4166-76, безводный. 

4-(п-Нитробензил)пиридин ч, ТУ 6-09-1593-74. 

Тетраэтиленпентамин ч, ТУ 6-09-8293-73. 

Тиокетон Михлера. 

Хлорамин. 

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-0563-73. 

Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-4530-77. 

Нингидрин, ТУ 6-09-10-1384-79. 

Диметиламинобензальдегид чда, ТУ 6-09-3272-77. 

Проявляющие реактивы: N 1 - 0,2% раствор 4-(п-нитробензил)пиридина в ацетоне и 10% раствор тетраэтиленпентамина в ацетоне; N 2 - 0,1% водный раствор хлорамина и 0,1% метанольный раствор тиокетона Михлера; N 3 - 0,5% раствор 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане; N 4 - 0,3% раствор бромкрезолового зеленого в 80% метаноле смешивают с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора; N 5 - 0,25% раствор нингидрина в спирте; N 6 - 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле смешивают перед употреблением с 1 мл ледяной уксусной кислоты. 

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79, свежеперегнанный. 

Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78, свежеперегнанный. 

Метиловый спирт хч, ГОСТ 6996-77. 

Натрий гидроксид хч, ГОСТ 4328-77. 

Уксусная кислота осч, ГОСТ 18270-72, ледяная. 

Неподвижная фаза: 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм, Хемапол, ЧССР). 

Азот особой чистоты, содержание O не более 0,003%, ГОСТ 

9293-79. 

Водород газообразный из баллона, ГОСТ 3022-80. 

Воздух газообразный из баллона, ГОСТ 9-010-80, или нагнетаемый компрессором. 

Основные стандартные растворы метаболитов ФОП в ацетоне по 100 мкг/мл. Хранят в холодильнике 2 мес. Рабочие стандартные растворы метаболитов ФОП, производных тио- и дитиофосфорной кислот по 100 мкг/мл и 1 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение 2-х месяцев. 

 

2.3. Приборы и посуда 

 

Газовый хроматограф с термоионным детектором (ТИД) марки "Цвет-100". 

Микроизмельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1505-79. 

Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1-М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный. 

Микрошприцы на 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2-833.024. 

Механический встряхиватель, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный. 

Хроматографическая камера с притертой крышкой, ГОСТ 25336-82. 

Мерные колбы, ГОСТ 1770-74 на 100 и 50 мл. 

Пипетки на 1, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74. 

Пробирки с пробками на шлифах, градуированные, ГОСТ 1770-74, на 10 мл. 

Круглодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100, 50 мл. 

Плоскодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100 мл. 

Чашки Петри, ГОСТ 25336-82. 

Мерные цилиндры, ГОСТ 1770-74, на 100 мл. 

Делительные воронки на 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82. 

Воронки химические, ГОСТ 25336-82. 

 

2.4. Подготовка и определение 

 

2.4.1. Отбор проб 

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб для определения микроколичеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, продуктах питания и объектах окружающей среды", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 за N 2051-79. 

2.4.2. Подготовка к определению 

Хроматографические камеры за 1 час до начала хроматографирования заполняют смесью растворителей гексан - ацетон (3:1) для подвижной фазы. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше чем 1 см от уровня дна камеры. Для ГЖХ-определения колонка заполняется общепринятым в хроматографии способом, кондиционируется в течение 48 часов при температуре на 20° выше рабочей температуры колонки. 

 

2.5. Описание определения 

 

2.5.1. Экстракция и очистка экстракта 

Органы и ткани (печень, почки, легкие, головной мозг) 

Исследуемые органы и ткани измельчают в микроизмельчителе тканей или на мясорубке. Отбирают 2 - 5 г средней пробы, заливают в зависимости от взятой навески 15 - 50 мл этилацетата и оставляют на 1 час, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой, или ставят на 30 мин. на аппарат для встряхивания. Затем растворитель сливают в круглодонную колбу для упаривания, фильтруя экстракт через фильтр с безводным сульфатом натрия. Заливают пробу новой порцией растворителя и экстрагируют еще 30 мин. Экстракт объединяют. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 40 - 45 °C до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) этилацетата. Доводят объем в пробирке этилацетатом точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют. 

Кровь. 2 - 5 мл цельной крови выливают в фарфоровую чашку. Затем прибавляют при непрерывном помешивании безводный сернокислый натрий (20 г) и тщательно растирают пестиком. Приливают 20 - 30 мл этилацетата и перемешивают пробу с этилацетатом в течение 10 мин. Сливают этилацетат в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C до 1 - 2 мл. Переносят остаток в мерную пробирку и доводят объем в пробирке этилацетатом до 2 мл. Аликвоту хроматографируют. 

Моча. 20 мл мочи переносят в делительную воронку, прибавляют 80 мл этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 2 мин. Дают отстояться. Отделяют верхний слой этилацетата, сливая его через сернокислый натрий. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают, как описано для крови. 

2.5.2. Хроматографическое определение 

Условия хроматографического определения 

ТСХ 

Остаток после концентрирования рабочей пробы наносят с помощью капилляра на пластинку "Силуфол". Аналогичным путем наносят серию стандартных растворов. 

Хроматограмму развивают в системе гексан - ацетон (3:1). После развития хроматограммы пластинку сушат, а затем проявляют одним из проявляющих реагентов. 

При проявлении пластин проявляющим реагентом N 1 хроматограмму 

сначала обрабатывают 0,2% раствором 4-(п-нитробензил)пиридина в 

ацетоне. Затем помещают в термостат при температуре 110 °C в 

течение 10 мин. и обрызгивают 10% раствором тетраэтиленпентамина в 

ацетоне. Метаболиты проявляются в виде насыщенно-синих пятен на 

белом фоне с R : ДМТФ - 0,22; ДЭТФ - 0,60; ДМДТФ - 0,36; ДЭДТФ - 

0,80. Линейный диапазон определения 0,1 - 2 мкг. 

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 2 хроматограмму обрабатывают 0,1% водным раствором хлорамина и через 10 мин. 0,1% раствором тиокетона Михлера в метаноле или этаноле. Зоны локализации метаболитов обнаруживаются в виде салатных пятен на желтом фоне. Линейный диапазон определения 0,1 - 10 мкг. 

При проявлении пластин проявляющим реагентом N 3 пластины обрабатывают 0,5% раствором 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане и нагревают 3 - 5 мин. при температуре 110 - 140 °C. Изучаемые соединения образуют красные пятна на белом фоне. Линейный диапазон - 1 - 20 мкг. 

Проявляющий реактив N 4 готовят перед опрыскиванием смешиванием 0,3% раствора бромкрезолового зеленого в 80% метаноле с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора. После опрыскивания тио- и дитиофосфорные кислоты проявляются в виде желтых пятен на зеленом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 20 мкг. 

При проявлении пластинки проявляющим реактивом N 5 10 мл 0,25% раствора нингидрина в спирте смешивают с 1 мл концентрированной уксусной кислоты и обрабатывают пластинку. Метаболиты ФОП проявляются в виде красных пятен на белом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 10 мкг. 

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 6 смешивают 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в этаноле с 1 мл ледяной уксусной кислоты и равномерно обрабатывают пластинку. Затем помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 110 °C, на 7 - 10 мин. Метаболиты образуют белые пятна на желтом фоне. 

ГЖХ 

Хроматограф марки "Цвет-100" с термоионным детектором. 

Колонка стеклянная спиральная, длина 1 м, диаметр 3 мм, заполненная 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм). 

-10 

Рабочая шкала электрометра при работе с ТИД 2 x 10 А. 

Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/час. 

Расход газа-носителя азота 22 мл/мин., водорода - 14 - 17 мл/мин., воздуха - 400 мл/мин. 

Температура колонки 120 °C, температура испарителя 160 °C. 

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных выше условиях ГЖХ-определения приведены в таблице 3. 

 

Таблица 3 

 

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ, ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ФОП 

 

TTTTT 

¦ Вещество ¦T уд.¦Неподвижная¦ T кол.,¦T исп.,¦ Нижний предел ¦ 

¦ ¦ ¦ фаза ¦ °C ¦ °C ¦обнаружения, мкг¦ 

+++++++ 

¦0,0-диметилтиофосфорная ¦1,25 ¦3% OV-17 ¦120 ¦160 ¦0,02 ¦ 

¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-диметилдитиофосфорная¦1,56 ¦3% OV-17 ¦120 ¦160 ¦0,05 ¦ 

¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-диэтилтиофосфорная ¦2,85 ¦3% OV-17 ¦120 ¦160 ¦0,02 ¦ 

¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

¦0,0-диэтилдитиофосфорная ¦2,11 ¦3% OV-17 ¦120 ¦160 ¦0,05 ¦ 

¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 

L+++++ 

 

2.6. Обработка результатов 

 

Метод ТСХ 

Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов. 

Содержание метаболитов в анализируемой пробе X в мг/кг вычисляют по формуле: 

 

C x V 

X = ------, 

V x P 

 

где: 

C - количество метаболита, найденного в хроматографируемой 

пробе, мкг; 

V - общий объем раствора, мл; 

V - объем аликвоты, отобранный для хроматографирования, мл; 

P - навеска пробы, г. 

ГЖХ 

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов (см. табл. 3). Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из 5 определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получают слишком большие пики, пробу разбавляют ЭА. Для определения метаболитов ФОП анализ проб следует проводить при температуре колонки (120 °C), использовав соответствующие стандарты (см. табл. 3). 

Расчет результатов анализа проводят по следующей формуле: 

 

C x V x H x V 

ст 1 3 

X = -----------------, 

V x H x P 

2 ст 

 

где: 

X - содержание метаболита в пробе, мг/кг (мг/л); 

C - количество метаболита в стандартном растворе, введенном 

ст 

в хроматограф, мкг/мл; 

V - объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, 

мкл; 

H - высота пика стандартного раствора, введенного в 

ст 

хроматограф, мм; 

H - высота пика исследуемого раствора, мм; 

V - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл; 

V - объем анализируемого экстракта, мл; 

P - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл). 

 

3. Техника безопасности 

 

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими веществами. 

 

 

 

Форум
Открылся форум WorkLib.ru